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細胞免疫熒光的具體實驗步驟介紹

更新時間:2022-09-08 00:00:00       點擊次數(shù):3952

  細胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導,細胞免疫熒光技術是利用免疫技術和熒光標記技術相結合,原理就是利用抗原-抗體反應之后,采用熒光標記,標記完成后,顯微鏡下觀察細胞內(nèi)某種抗原成分的多少,從而做出一個定位研究,也可以為細胞內(nèi)信號傳導提供一個明確的指導,細胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點,是目前比較常用的組織學技術,也是比較精確的。
  細胞免疫熒光實驗步驟:
  首日:
  1.在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3min;
  2.用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min;
  3.0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);
  4.PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30min;
  5.吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜;
  次日:
  6.加熒光二抗:PBST浸洗爬片3次,每次3min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min;注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
  7.復染核:滴加DAPI避光孵育5min,對標本進行染核,PBST5minx4次洗去多余的DAPI;8.用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

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