KI小鼠模型構建

簡要描述：基因敲入（Knock-in, KI）小鼠通過在基因組特定位點精準插入外源序列（如報告基因、人類疾病突變或條件性表達元件），是研究基因功能調控、人類疾病模擬和藥物測試的核心工具

更新時間：2025-06-26 17:14:44
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一、KI小鼠模型構建技術路線選擇

方法	周期	插入片段限制	適用場景
CRISPR-HDR	2-4個月	<5 kb	快速構建短片段KI（如點突變、FLAG標簽）
ES細胞同源重組	6-12個月	無限制	大片段插入（如Cre重組酶、人源化基因）
CRISPR-轉座子/病毒	3-5個月	10-50 kb	超大片段插入（如BAC轉基因替代）

二、KI小鼠模型構建CRISPR-HDR方案（短片段插入推薦）

1. 靶點設計與供體制備

gRNA設計：

靶向插入位點（避開功能域），使用CHOPCHOP優(yōu)化效率。

供體DNA設計：

5'同源臂 60-100nt

目標序列+篩選標記*

3'同源臂 60-100nt

化學修飾：ssODN（單鏈）需3'硫代磷酸酯化，dsDNA（雙鏈）需磷酸化。
沉默突變：在gRNA靶區(qū)引入1-2 bp突變防止重切（必需?。?。

2. 受精卵注射

注射混合物：

Cas9蛋白 (50 ng/μL) + gRNA (25 ng/μL) + ssODN/dsDNA (100 ng/μL)。

胚胎移植：

移植20-30個注射后胚胎至假孕母鼠。

3. 基因型鑒定

PCR策略：

外側引物（同源臂外） + 內側引物（插入序列內）→ 僅陽性鼠能擴增。
測序驗證：確保插入序列無indel突變。

4. 品系建立

F0嵌合體：與野生型交配，篩選生殖系傳遞后代（通常50%概率）。

三、ES細胞同源重組方案（大片段KI）

1. 靶向載體構建

5'同源臂 1.5-3kb

目標序列

FRT-flanked NeoR

3'同源臂 1.5-3kb

DTA負選標記

關鍵元件：

同源臂：長度與插入片段正相關（>5 kb插入需≥3 kb同源臂）。
篩選標記：NeoR（后續(xù)可通過Flp刪除）。

2. ES細胞操作

電轉與篩選：

G418（NeoR）篩選10-14天，Pick 200-300個克隆。

陽性克隆驗證：

長片段PCR（覆蓋整個插入區(qū)域）。
Southern blot：確認單拷貝整合。

3. 小鼠制備

囊胚注射：將陽性ES細胞注入C57BL/6N囊胚。
傳代：嵌合體與Flp deleter小鼠交配刪除NeoR。

四、條件性KI（cKI）附加設計

1. 雙loxP系統(tǒng)

策略：在目標基因前插入loxP-stop-loxP（LSL）結構，與Cre小鼠交配后激活表達。
應用：

報告基因：Rosa26-LSL-tdTomato。
致癌基因：Kras-LSL-G12D。

2. 誘導型系統(tǒng)

Tet-On：rtTA + TRE-目標基因，需多xi環(huán)素誘導。

五、經典KI模型案例

插入類型	應用	代表模型
點突變	模擬人類遺傳?。ㄈ鏏PP突變）	APP-KI（阿爾茨海默?。?/p>
報告基因	細胞譜系追蹤	Rosa26-CAG-LSL-GFP
人源化基因	藥物測試	hCYP3A4-KI（代謝研究）

六、關鍵優(yōu)化策略

提高HDR效率：

添加HDR增強劑（如Rad51 mRNA或RS-1）。
使用Cas9變體（如Cas9-D10A nickase）。

減少隨機整合：

線性化供體DNA（避免質粒骨架整合）。

表型驗證：

mRNA水平：qPCR檢測插入基因表達。
蛋白水平：抗體檢測（如HA/FLAG標簽）。

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